摘要 BACTEC MGIT960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪能大大缩短分枝杆菌的检测时间,结核分枝杆菌平均为7.2天,非结核分枝杆菌最快仅需1天即可报告结果,该仪器自动化程度高、污染率低,每小时自动进行质量控制,还可进行药效学的初步研究。
传统检测结核分枝杆菌的方法简单、经济、易于推广使用,但是存在着检测周期长、阳性检出率低、不易标准化、费时费力等缺点(完成标本分离培养、菌型鉴定、药物敏感试验全部过程需要耗时2~3个月)。如何快速检测结核分枝杆菌已成为该领域中迫切解决的课题。二十世纪七十年代末,世界上第一全自动分枝杆菌培养鉴定仪BACTEC 460TB研制成功,使快速分离结核分枝杆菌成为现实,但由于当时科学技术的限制,其采用放射性14C棕榈酸为底物,检测反应过程中释放出的含有放射性的14CO2计算出其生长指数GL。随着科学技术的进步,该系统不断改进完善,新式机型不断涌现,更加适合现代临床检验学发展的需要。美国JOHNSTON实验室公司(TOWSON,MD)于1996年新研制成功了无放射性污染BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪,实现了分枝杆菌安全、环保、无放射性检测。在亚洲地区我院于1998年底率先引进了该仪器。为了解其性能在实际工作中的应用,我们运用不同的实验方法进行对比分析研究,得到较好的结果。
1 材料与方法
1.1 材料:L-J(罗氏)培养基(自制),BD公司BACTECMGIT 960全自动分枝杆菌快速培养鉴定药敏仪及其配套试剂(包括MGIT培养管、MGIT OADC营养添加剂、PAN-TA杂菌抑制剂),BACTEC 460 TB全自动分枝杆菌培养鉴定仪及其配套试剂,MGIT 7H9培养基(购自BD公司),标本消化/去污染处理液(自制),聚合酶链反应(PCR)试剂自制。
检测标本90例,系我院未确诊住院病人送检标本,种类包括:痰液69例、尿液10例、胸腹水5例、脑脊液3例、关节液2例、淋巴液1例。
1.2 方法:将MGIT培养管在无菌条件下分别加入0.8mlMGIT PANTA/OADC混合液备用。送检标本经常规消化
去污染浓缩处理后,分别接种于L_J(罗氏)培养基及已准备好的12B培养瓶和MGIT培养管中,将MGIT培养管置入BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪孵育培养。BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度,判断管内分枝杆菌的生长情况。若出现阳性标本,仪器红色指示灯立即闪亮,同时有报警提示音。按仪器操作步骤提示取出阳性标本,并自动打印出结果。
1.3 BACTEC MGIT960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪的应用原理是:该仪器采用荧光法的原理,MGIT培养
管底部包埋有荧光显示剂,直接感应培养管内氧气浓度。当培养管内有分枝杆菌生长时,氧气被消耗,荧光显示剂在
二极管的激发下发出荧光, BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度,并通过数据处理得出阳性结果,以生长单位(GU,Growth Unit)形式报告,并直接打印出结果。阳性培养管取出后直接涂片进行抗酸染色以确定是否为分枝杆菌,并可立即分离分枝杆菌的菌种,制备菌悬液,第二次接种于预先配制好的含
有药物敏感试验所需标准浓度药物的MGIT培养管(含OADC)及空白对照MGIT (含OADC)培养管,然后置入仪器内进行培养,根据分枝杆菌的生长情况对比而判断该药物敏感性。根据PNB(对硝基苯甲酸)及TCH(噻吩-2-羧酸肼)的药敏试验结果可进行分枝杆菌菌种的初步鉴定。
2 结果
2.1 90例送检标本阳性检出率为63.33%(57/90),其中各类标本阳性检出比例分别为:痰液47/69;尿液6/10;胸腹水2/5;脑脊液1/3;关节液1/2;淋巴液0/1。
2.2 BACTECMGIT960全自动分枝杆菌快速培养鉴定药敏仪初代分离标本阳性报告时间(以30例标本统计)平均为7.2天,快速生长的非结核分枝杆菌仅需1天;BACTEC460 TB初代分离标本阳性报告所需时间平均为9.7天,快速生长菌(在7天以内生长出来的非结核分枝杆菌为快速生长菌)需要3天;MGIT 7H10培养管手工培养平均需要20.2天,快速生长菌平均需要10天;L-J罗氏培养基平均需要29.4天,快速生长菌平均需15天报告结果。(见表1)
2.3 四种方法对比分析的阳性检出率中,BACTEC MGIT960与BACTEC 460 TB无明显差异。与MGIT7H9培养管手工法和L-J罗氏培养基法比较,阳性检出率高出10%,有显著差异(P<0.05)。在污染率方面,BACTEC 460 TB比BACTEC MGIT 960高。
2.4 BACTEC MGIT 960与聚合酶链(PCR)法比较。PCR检出的20例阳性标本中,BACTEC MGIT 960检出率为
80%(16/20),L-J罗氏培养基检出率为70%(14/20);BACTEC MGIT 960检出的20例阴性标本,L-J罗氏培养基检出也为阴性,而PCR法则又检出3例阳性标本。
2.5 运用BACTEC MGIT 960进行药效学试验研究,根据菌液接种量为102CFU/ml时,无药对照组每日生长指数达到30时,连续观察3天,对照组生长指数每日增加,而药效观察组生长指数不增加的培养管中药物浓度最低的为该药最低抑菌浓度即为该药MIC值,该药MIC值为1mg/L.研究测定甲磺酸氧氟沙星的最低抑菌浓度即为该药MIC值,该药MIC值为1mg/L。研究测定甲磺酸氧氟沙星的最低杀菌浓度(MBC),菌液接种量为102CFU/ml,该药的MBC浓度为2mg/L,药物在8~10小时内把结核分枝杆菌杀死,其细菌生长曲线见图1,平均药敏培养时间为5天,而L-J罗氏法则需要26天。
3 分析
自Middlebrook(1)(2)等于1977年介绍用含有放射性的14C棕榈酸为底物的7H12培养基专门用于检出结核及其它分枝杆菌(BACTEC法)后,JOHNSTON实验室公司(TOW-SON,MD)推出了BACTEC 460 TB(3)全自动分枝杆菌培养鉴定仪,已广泛应用于世界各地。最近该公司又新研制成功BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌快速培养鉴定药敏仪,通过对四种方法的对比分析, BACTEC MGIT96 0初代分离比BACTEC4 6 0 TB提前2天报告结果(见表1),且适用于各类标本的检测,比传统方法提高阳性检出率10%。比BACTEC 460 TB污染率低,截止到2000年1月为止,250例标本无一例污染,并且无放射性污染,减少了对医务人员、对环境、对样本的污染。因BACTECMGIT 960主要检测活菌,故与PCR检测去(PCR法可测死菌)阳性检出率有一定差距。
BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌快速培养鉴定药敏仪还可进行科研工作,该仪器的药敏法传统药敏方法有高度相关性(4),可进行药效学动态基础研究,而且快速、简便、数据准确、易质控,可减轻工作人员的工作量和提高操作的安全性。不足之处是培养基价格偏高,若能自行研制培养基,则更利于该仪器的推广使用。
参考文献:
1 Leonid B Heifets. Rapid automated methods (BACTEC System)inclinical mycobacteriolgy, Semin Respir infect. 1986;1:242.
2 Laszlo A, et al. Radiometric diagnosis of mycobacteria J Clin Microbil.1986;5:152.
3 张立兴等,自动快速检测结核菌及其它分枝杆菌BACTEC法的研究及应用,中国防痨杂志, 1991;12:35。
4 张培元,等BACTEC 460临床标本检测分析,中国防痨杂志,1993;15:164.
本文作者：李洪敏 吴雪琼 王巍 夏湘宣 郑忠国
