GST表达
融合蛋白
载体
pGEX-KG
大小：5006bp，氨苄青霉素抗性(Ampr)，
iptg诱导
表达
酶
切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994
GST
分子量
：
构建pGEX-KG-YFG重组
质粒
1、分析所感兴趣的基因(your favorite
GENE
, YFG)
Primer Premier 5.0软件，分析YFG含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG载体的多克隆位点有重合
2、确定合适的双酶切位点
NEB网站(www、neb、com) Double Digest Finder软件，查找最佳双酶切组合(下表)
NEB双酶切图谱 BamHI EcoRI NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. BamHI may exhibit star activity in this buffer. XbaI NEBuffer 3 + BSA at 37°C. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. NcoI NEBuffer 3 + BSA at 37°C. SalI NEBuffer 3 + BSA at 37°C XhoI NEBuffer 3 + BSA at 37°C. SmaI XbaI NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XbaI ａnd raise temperature to 37°C. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. NcoI NEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add NcoI ａnd raise temperature to 37°C. XhoI NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XhoI ａnd raise temperature to 37°C. SacI NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add SacI ａnd raise temperature to 37°C. HindIII NEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add HindIII ａnd raise temperature to 37°C. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. EcoRI NcoI NEBuffer EcoRI at 37°C. SalI NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. XhoI NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. SacI NEBuffer 1 + BSA at 37°C. EcoRI may exhibit star activity in this buffer. HindIII NEBuffer EcoRI at 37°C. XbaI NcoI NEBuffer 2 + BSA at 37°C. SalI NEBuffer 3 + BSA at 37°C. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. XhoI NEBuffer 2 + BSA at 37°C. SacI NEBuffer 4 + BSA at 37°C. This buffer is not supplied with either enzyme.
At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. HindIII NEBuffer 2 + BSA at 37°C. NcoI SalI NEBuffer 3 + BSA at 37°C. XhoI NEBuffer 2 + BSA at 37°C. SacI NEBuffer 1 + BSA at 37°C. HindIII NEBuffer 2 at 37°C. SalI XhoI NEBuffer 3 + BSA at 37°C. XhoI SacI NEBuffer 1 + BSA at 37°C. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. HindIII NEBuffer 2 + BSA at 37°C. SacI HindIII NEBuffer 2 + BSA at 37°C. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
对照YFG、载体多克隆位点，确定上、下游酶切位点
3、设计PCR上、下游引物
Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物
酶切位点外最多含6个碱基
3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾
3’端至少保证有10个碱基完全配对
得分(Rating)大于70
[注意]
上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框
下游引物：添加终止密码子(UAA、UAG、UGA)
4、引物合成及保存
合成：上海生工生物工程技术服务有限公司(Email：beijing@sangon、com，Tel：81767586);纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳?;价格1.30/碱基
保存：贮存浓度：100pmol/μl(100μM)，工作浓度：10pmol/μl(10μM)，-20°C保存
5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl 稀释少量 -20°C保存
引物：10pmol/μl(10μM) -20°C保存
Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb
反应体系(配制时置于冰上)
25μl反应体系 50μl反应体系 模板 1μl 2μl 上游引物 1μl 2μl 下游引物 1μl 2μl 2×Master Mix 12.5μl 25μl 去离子H2O 9.5μl 19μl
反应条件
(1) 预变性 94°C 5 min
(2) 变性 94°C 30 s
(3) 退火 待定 30 s
(4) 延伸 72°C 待定
(5) 重复2-5 25-30个循环
(6) 补平缺口 72°C 10 min
(7) 暂存 10°C
[注意]
退火温度：参考4(G+C)+2(A+T)-4(互补碱基)，参考Ta Opt(Primer Premier 5.0)
延伸时间：Taq酶：1kb/min
循环数小于30，减少错配
琼脂糖电泳检测PCR产物
0.8%有效分离范围：10~0.8kb;1.0%有效分离浓度7~0.5kb
50ml TAE加入5μl EB母液(5mg/ml)
100V，30-45min
拍照或者紫外灯下切胶回收
6、构建pGEX-KG-YFG
酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG
回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收
连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng
转化铺平板：Ampr
挑单克隆：Ampr(四个菌落足够了)
鉴定：小提质粒酶切 or菌体 PCR
7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达
(1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根)
(2)2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒(300-500ng)，混匀(质粒≤感受态1/10)
(3)冰上放置30min
(4)42°C，90s
(5)冰上放置2-3min
(6)加入300μl LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB)，37°C，250rpm，1 h
(7)4000rpm，2min，弃上清，其余混匀以后涂平板(Ampr)，37°C，过夜(16 h)
(8)挑单克隆菌落，5ml LB(Ampr)，37°C，250rpm，过夜(16 h)
()稀释10倍、20倍、50倍测定OD600
()选择合适的稀释倍数，5ml菌液，37°C，250 rpm，1 h，测定OD600
(7)取100μl菌液加入5ml LB(Ampr)(50倍稀释)，37°C，250rpm，过夜(16 h)
(8)取500μl菌液加入5ml LB(Ampr)(10倍稀释)(其余菌液4°C保存)，测OD600
(9)37°C，250 rpm，2 h(OD600：0.6-0.8)，测OD600
(10)室温放置20 min(摇床降温，30°C)
(11)取100μl作为诱导前对照，冰上放置
(12)菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1 mM
(13)30°C，250 rpm，2 -4h(可做时间梯度)，测OD600
(14)取100μl作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，加入50μl 1×SDS上样缓冲液
(15)取4ml菌液，12000rpm，离心2min，收集到2ml离心管中
(16)加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体
(17)超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度200-300W(冰浴)
(18)超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4°C，12000rpm，离心5min
(19)超声后上清：取25μl上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)
(20)超声后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬，取25μl，加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存)
(21)将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
(22)8-10%SDS-PAGE，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
(23)考马斯亮蓝染色
[注意]
(1)菌液OD值小于1即可
(2)诱导时间最好做一个梯度，2-6h
(3)诱导温度适当摸索，24°C、30°C
(4)IPTG浓度可做梯度，1mM
(5)超声条件可视实际情况改变，只要使细菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠
8、测序确认
上海生工生物工程技术服务有限公司(Tel：81767529)
测序引物：pGEX-3通用引物
测序样品：过夜菌1ml;质粒(浓度大于50ng/μl，10μl)
9、中提质粒(Promega)
10、表达纯化GST融合蛋白
(1)已经转化的菌液，或者重新转化BL21(DE3)pLysS
(2)活化：取20μl菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀释)，37°C，250rpm，过夜(16 h)
(3)取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀释)(剩余菌液4°C保存)
(4)37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8(OD600小于1.0即可)
(5)取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置
(6)加入IPTG，终浓度1 mM
(7)30°C，250rpm，诱导适当时间(预实验确定)
(8)取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液
(9)其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞
(10)每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中(无气泡)
(11)超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W(冰浴)
(12)将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min
(13)将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)
(14)将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液(或PBS)重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存)
(15)将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
(16)8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
(17)考马斯亮蓝染色
(18)混匀glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry)，取200μl加入15ml离心管中(2份)
(19)加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清
(20)加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放)
(21)4°C，3000rpm，离心3min
(22)10ml GST裂解缓冲液洗涤2次(冰上)
(23)10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗涤2次(冰上)
(24)弃上清，加入1倍柱床体积的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油)，混匀
(25)取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE
(26)-20°C保存beads
11、GST-Pull-down
(1)10cm培养皿中，未处理的细胞或者转染的细胞(3-5μg质粒转染10cm培养皿，Cos-7、293T或者其他细胞，转染24h)
(2)加入1ml 细胞裂解缓冲液，细胞铲刮下细胞(冰上)
(3)将裂解液收集到1.5ml离心管中，振荡30s，冰上放置5min，重复2-3次，充分裂解细胞
(4)4°C，12000rpm，离心15min，收集上清
(5)测定蛋白浓度，取1mg总蛋白做GST-Pull-down?
(6)留30μl作为input对照(input与Pull-down蛋白量约为1/10)
(7)其余溶液，加入20μl glutathione sepharose beads(PBS洗涤过)，4°C，轻柔振荡20min
(8)12000rpm，离心3min
(9)收集上清，分为两份，一份加入1-15μg GST结合的beads，另一份加入等量 GST-融合蛋白结合的beads，4°C，轻柔振荡60min
(10)3000rpm，离心3min，回收上清
(11)1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次
(12)弃尽上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液
(13)煮沸3min，12000rpm，离心3min
(14)SDS-PAGE，上样顺序：细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白(x：LSB)
(15)考马斯亮蓝染色或免疫印迹
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