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核酸探针实验应该注意什么-华强电子网

来源:华强电子网 作者:华仔 浏览:279

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摘要: 实验原理分子生物研究中,最常用的探针即为双链DNA探针,它广泛应用于转基因植物拷贝数的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去

实验原理

分子生物研究中,最常用的探针即为双链DNA探针,它广泛应用于转基因植物拷贝数的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。

实验试剂

(1) 10×切口平移缓冲液: 0.5M/L Tris-Cl (pH7.2); 0.1M/L MgSO4; 10mM/L DTT; 100ug/ml BSA。

(2) 未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mM/L。

(3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。

(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ:(4单位/ul):溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油,50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。

(5) DNA酶:1mg/ml。

(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。

(7) 10M/L NH

4

Ac。

实验步骤

(1) 按下列配比混合:

    未标记的dNTP 10ul

    10×切口平移缓冲液 5ul

    待标记的DNA 1ug

    [α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul

    E.coli DNA聚合酶 4单位

    DAN酶 I 1ul

    加水至终体积 50ul

(2) 置于15℃水浴60分钟。

(3) 加入5ul EDTA终止反应。

(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5M/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。

注意事项

1、3H,32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记,但通常使用[α-32P]-dNTP。

 2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探针比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,则所得探针比活性高,但长度比较短。

型号 厂商 价格
EPCOS 爱普科斯 /
STM32F103RCT6 ST ¥461.23
STM32F103C8T6 ST ¥84
STM32F103VET6 ST ¥426.57
STM32F103RET6 ST ¥780.82
STM8S003F3P6 ST ¥10.62
STM32F103VCT6 ST ¥275.84
STM32F103CBT6 ST ¥130.66
STM32F030C8T6 ST ¥18.11
N76E003AT20 NUVOTON ¥9.67
型号/产品名 平均报价 涨跌幅
STM8S003F3P6 1.55 1.12%
74HC573D 0.64 2.86%
2N7002 3.66 400.00%
STM32F103C8T6 7.47 27.87%
1N4007 1.58 0.00%
ADM2483BRWZ 8.90 3.21%
SHT10 16.21 5.88%
STM32F103RCT6 12.56 24.44%
78L05 10.55 66.67%
LM358 118206.75 16.67%
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