实验步骤

首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物不能在模板的非目的位点引发

DNA

聚合反应

（

即错配

）

，再次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引物设计应注意如下要点：

1

．引物的长度一般为

15-30 bp

，常用的是

18-27 bp

。

2

．引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是

3

’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物

3

’端出现

3

个以上的连续碱基，如

GGG

或

CCC

，也会使错误引发机率增加。

3

．引物

3

’端的末位碱基对

Taq

酶的

DNA

合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为

A

的错配效率明显高于其他

3

个碱基，因此应当避免在引物的

3

’端使用碱基

A

。

4

．引物序列的

GC

含量一般为

40-60%

，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的

GC

含量不能相差太大。

5

．引物的另一个重要参数是熔解温度（

Tm

）。这是当

50

％的引物和互补序列表现为双链

DNA

分子时的温度。合理的退火温度从

55

℃到

70

℃。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的

Tm

值。

6

．引物二聚体或发夹结构也可能导致

PCR

反应失败。应该尽量避免。